近日，转化医学国家重大科技基础设施（上海）耐药肿瘤精准诊疗材料及临床应用研究用户工作站窦红静教授团队与治疗性人工细胞系统的开发与应用研究用户工作站Stephen Mann团队联合，在膜化原始细胞模型中实现适应性ATP诱导分子凝聚领域取得新进展，相关研究成果以“Adaptive ATP-induced molecular condensation in membranized protocells”为题发表在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上。（论文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2419507122）
1. 研究背景
在生物细胞中，区室化是实现功能复杂性的驱动力，细胞内的分隔不仅有助于细胞器的形成，还能保证生命过程的正交性和有序性。例如，真核细胞通过液-液相分离（LLPS）形成无膜细胞器，并在细胞质中通过蛋白质和核酸的非平衡通量自发组装和分解，形成可逆的相分离过程。尽管在各种细胞模拟（原始细胞）模型中已经实现了液-液相分离，但使用生物活性物质系统地控制分子凝聚状态以改变原始细胞功能仍然是一项挑战。细胞内ATP水平通过影响蛋白质间相互作用从而改变细胞中分子间互作动力学，并干扰凝聚物的形成。因此，开发一种能够模拟细胞内复杂拥挤环境的原始细胞模型，对于理解细胞功能和设计先进的生物技术应用具有重要意义。
2. 工作简介
受天然细胞中的液-液相分离过程启发，上海交通大学材料科学与工程学院窦红静教授和Stephen Mann教授研究团队构筑了一种基于半透性多糖微囊（polysaccharidosomes）的原始细胞模型，该模型能够实现ATP调控下的可控相分离和适应性分子拥挤。通过模板引导组装技术构筑了均匀的区室化仿细胞微囊，此原始细胞能够进行精确的扩散介导的相变。
相关研究成果以“Adaptive ATP-induced molecular condensation in membranized protocells”为题发表于Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America。该研究为理解细胞内拥挤环境下分子间相互作用动力学和带电分子在生物凝聚物中的作用提供了新的见解。
3. 主要研究内容
· 原始细胞模型的构建以及在原始细胞内实现液-液相分离过程
首先，研究团队开发了一种全水相构筑法，用于批量生产大小均匀的半透性多糖基微囊（polysaccharidosomes，P-somes）。首先通过控制多糖大分子在牺牲性微模板上的组装，随后进行膜交联和模板溶解，从而制备了P-somes。蛋白质（如牛血清白蛋白BSA）在微模板生长过程中被掺入，并在模板溶解后直接被截留并释放到原始细胞的腔体中。研究发现，通过向含有BSA的P-somes中加入膜可渗透的低分子量聚阳离子二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-Dex），可以诱导自发扩散介导的液-液相分离，在原始细胞内形成BSA/DEAE-Dex凝聚液滴（图1）。
图1. 在原始细胞模型中实现可控液-液相分离过程
· 原始细胞模型中实现ATP诱导的适应性分子凝聚
进一步地，研究团队通过向P-somes中加入不同浓度的ATP，观察到凝聚物从液态向液-凝胶态的转变。首先，通过外源性对pH调节，实现诱导含有BSA的P-somes原始细胞摄取ATP，从而引发蛋白/核苷酸凝聚。在酸性至生理条件下逐步增加ATP浓度，可逆地形成具有分子拥挤的液体或凝胶状内部的原始细胞。此外，向含有局部BSA/DEAE-Dex凝聚体的P-somes原始细胞中添加ATP，当ATP浓度低于5.0 mM时，凝聚体保持液态；当ATP浓度超过阈值（5.0至10.0 mM），凝聚体相变为凝胶态。由于ATP对BSA基质的交联作用，减少了P-somes原始细胞内受限凝聚体液滴中的大分子扩散（图2）。
图2. 通过对pH和ATP浓度的调控实现P-somes原始细胞模型中的适应性分子凝聚体的动态变化
· 通过分子凝聚体调控P-some原始细胞中的内源性酶活性
随着原始细胞对ATP摄取量的增加（ATP浓度从1.0 mM到10.0 mM），辣根过氧化物酶（HRP）在凝聚态原始细胞内的固定化程度逐渐提高。随着分子拥挤程度的逐渐增加，同时在外部环境中存在葡萄糖氧化酶（GOx）的情况下，对于较低和中等程度的分子拥挤，可以显著增强酶级联反应速率，而随后在高ATP摄取产生的凝胶状凝聚体存在时，显著抑制HRP酶活性，进而通过原始细胞中分子凝聚的状态实现对酶功能活性的调控（图3）。
图3. 通过凝聚体中分子的扩散状态实现对P-somes原始细胞中的内源性酶活性的调控
· 原始细胞内实现核酸介导的信息交换
研究团队进一步探索了在P-somes原始细胞内实现单链DNA寡核苷酸的摄取和链置换反应。通过向含有输入链的P-somes原始细胞中加入ATP，可以增加分子凝聚水平，进而影响DNA链置换反应的效率。在高ATP浓度下，由于扩散限制，淬灭链和置换链无法有效进入P-somes内部，导致链置换反应的停止（图4）。
图4. 原始细胞内实现由核酸介导的可控信息交换过程
4. 结论和展望
这项研究展示了一种基于半透性多糖微胶囊的原始细胞模型，该模型能够实现可控相分离和适应性分子拥挤。通过ATP诱导的分子凝聚，能够系统地改变原始细胞内的功能，为理解细胞内拥挤动力学和生物凝聚物的作用提供了新的平台。这项研究不仅为人工细胞领域带来了新的突破，也为理解生物细胞内的复杂动态过程提供了新的视角和工具。随着研究的深入，此类原始细胞模型有望在更多领域展现出其独特的价值和应用前景。
上海交通大学材料科学与工程学院博士后Vincent Mukwaya为论文的独立一作，上海交通大学材料科学与工程学院博士生于小蕾、助理研究员杨朔为论文的共同作者，上海交通大学材料科学与工程学院窦红静教授和Stephen Mann教授为论文的共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划（2022YFE0100600）、自然科学基金（52150410403）、上海市属高校特聘教授（东方学者）跟踪计划（SHDP201802）、国家转化医学设施（上海）转化医学交叉研究基金（YG2021QN09）、上海交通大学“交大之星”（STAR）计划（No. 20240303）等基金的资助。
